原料奶中病原菌的调查及代表性病原菌的研究

摘要：对榨乳过程进行了采样分析, 确定了原料奶中的主要致病菌为金黄色葡萄球菌, 并分析了原料奶在不同温度储存时金黄色葡萄球菌的生长情况以及金黄色葡萄球菌在酸奶发酵和冷藏过程中的存活情况。研究发现, 酸奶的低酸性环境并不能有效的抑制金黄色葡萄球菌的生长, 所以为了产品的安全性, 要对奶牛的乳房炎和隐性乳房炎进行有效防治, 并严格控制榨乳的卫生条件及原料奶的储存温度。本文对某牧场的奶牛进行取样分析, 找出原料乳中具有代表性的致病菌, 并进行研究。主要调查原料乳中常见的致病菌, 包括: 金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单核增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、大肠杆菌。

1 试验方法
1.1 致病菌的选择性调查
1.1.1 检测方法
GB / T4789.6- 2003 致泻大肠埃希氏菌检测方法;
GB/ T4789.4- 2003 沙门氏菌检测方法;
GB/ T4789.5- 2003 志贺氏菌检测方法;
GB / T4789.8- 2003 小肠结肠炎耶尔森氏菌检测方法;
GB/ T4789.9- 2003 空肠弯曲菌检测方法;
GB / T4789.10- 2003 金黄色葡萄球菌检测方法;
GB/ T4789.14- 2003 蜡样芽孢杆菌检测方法;
GB / T4789.30- 2003 单核细胞增生李斯特氏菌检测方法。
1.1.2 取样方法
a) 乳房: 涂抹采样, 用棉签蘸生理盐水在奶牛乳房处广泛涂抹, 并制成混合样, 放入的生理盐水瓶中, 冷藏。
b) 牛体后臀: 涂抹采样, 用棉签蘸生理盐水在奶牛后臀处大面积涂抹, 并制成混合样, 放入的生理盐水瓶中, 冷藏。
c) 榨乳罩杯: 涂抹采样, 用棉签蘸生理盐水在罩杯内壁, 尤其是垫圈处广泛涂抹, 制成混合样, 放入的生理盐水瓶中, 冷藏。
d) 空储罐: 涂抹采样, 用棉签蘸生理盐水在空储罐内壁广泛涂抹, 并制成混合样, 放入的生理盐水瓶中, 冷藏。
e) 取样器: 涂抹采样, 用棉签蘸生理盐水在取样器内部广泛涂抹, 放入的生理盐水瓶中, 冷藏。
f) 头三把奶: 采集多头奶牛挤出的头三把奶制成混合样, 放入瓶中, 冷藏。
g) 储罐中奶: 采集不锈钢储罐中的混合奶样, 放入瓶中, 冷藏。
h) 冲洗用水: 采集生活用水样品, 放入瓶中, 冷藏。
i) 牛粪: 采集多个牛的牛粪制成混合样, 放入的生理盐水瓶中, 冷藏。

储罐

不锈钢储罐

1.2 代表性致病菌在原料乳中存活的研究
1.2.1 致病菌菌液的制备
将致病菌的标准菌株连续活化两次, 然后将活化好的菌液放在 4℃恒温箱内备用; 同时用的蛋白胨水进行一系列的稀释, 涂平板, 培养计数。
1.2.2 原料乳的接种
将致病菌的菌液接种到原料乳中, 使乳中致病菌的浓度达到 103cfu / mL。接种后的奶样分别放在 4℃、8℃、15℃、20℃、25℃恒温箱中培养 24 h。
1.2.3 致病菌的计数
从接种开始每 4 h 取一次样, 然后进行梯度稀释, 涂平板, 培养计数。
1.3 代表性致病菌在酸乳制备及冷藏过程中的存活研究
1.3.1 致病菌菌液的制备
将致病菌的标准菌株连续活化两次, 然后将活化好的菌液放在 4℃恒温箱内备用; 同时用的蛋白胨水进行一系列的稀释, 涂平板, 培养计数。
1.3.2 酸乳的制备及冷藏
取鲜牛乳 200 mL, 并加入 12 g 蔗糖于 90℃灭菌 30 min, 待冷却至 45℃时进行接种。添加发酵剂总量为牛乳质量的 3 %, 保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的添加量分别为 1.5%; 同时每瓶牛乳中分别加入 0.2 mL 含有如下浓度的致病菌菌液: 108cfu / mL、107cfu / mL、106cfu / mL、105cfu / mL、104cfu / mL,并于 43 ℃进行保温发酵 3 h。将凝固成型的酸乳置4 ℃保存 3 d。
1.3.3 致病菌的计数
从酸乳发酵开始到发酵结束每半小时取一次样, 冷藏过程中每 24 h 取一次样, 进行梯度稀释,然后涂布于鉴别培养基上, 培养计数。
1.3.4 滴定酸度及 pH 值的测定
滴定酸度用吉尔涅尔度( °T )表示: 取 100 mL牛乳 ( 为了节省原料, 我们取 10 mL 来滴定, 这时需要将碱液的消耗数乘以 10) , 用酚酞作指示剂,以 0.1 mol / L 的 NaOH 来滴定, 按所消耗的毫升数来表示, 消耗 1 mL 为 1°T 。在每次计数时, 取出10 mL 奶样放入小三角瓶内, 用于测定酸度, 同时取出 5 mL 奶样放入试管内, 用 pH 计测定其 pH值。
2 结果与讨论
2.1 原料奶致病菌的调查
按照国标检验方法对 9 个样品中的 8 种常见致病菌进行了调查, 可以看出:
a) 在的样品中未检出空肠弯曲杆菌、志贺氏菌、单核增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌, 表明这几种菌在该季节 ( 秋季) 生长不活跃, 可不作为危害乳制品原料的关键性致病菌的必检菌。
b) 沙门氏菌仅在牛粪中检出, 说明此季节环境中没有这种菌的危害; 而牛后臀未检出这种菌更说明了牛粪中沙门氏菌的量也很少, 对奶牛和周围的环境不构成威胁, 因此沙门氏菌不作为代表性致病菌。
c) 原料奶中的大肠杆菌主要是由牛粪造成的, 调查结果发现大肠杆菌仅在牛粪和牛后臀中检出, 而牛乳房未检出此菌说明奶站的奶牛基本健康且生活环境没有被, 所以大肠杆菌不作为代表性致病菌。
d) 除冲洗用水外检出金黄色葡萄球菌, 表明部分奶牛患有乳房炎或隐性乳房炎, 而且说明金黄色葡萄球菌是存在为广泛的致病菌, 能够从各种渠道原料奶。
2.2 金黄色葡萄球菌在原料乳中存活的研究
正常情况下, 挤出的原料奶应立即冷藏并及时运送到工厂进行加工处理。但是很多散奶户没有冷藏设施, 又由于奶户比较分散, 所以不能做到及时收检; 而在一些牧场产奶量低的时候, 早上挤出的原料奶一般就会与晚上挤出的原料奶一起运送到工厂, 当冷藏设施不完善时, 就涉及到原料奶长时间的储存问题。因此本试验的目的就是给那些不能将原料奶及时送到工厂加工的奶户和牧场提供一个安全指导, 在金黄色葡萄球菌多发季节对不同温度下储存的原料奶作出安全评价。原料奶中接种了金黄色葡萄球菌( 1.2×103cfu / mL) 后, 分别在 4 ℃、8 ℃、15 ℃、20 ℃和 25 ℃下储存 24 h, 金黄色葡萄球菌的变化情况。由图 1 可知, 25 ℃储存时, 4 h 以后金黄色葡萄球菌就开始迅速生长, 到 8 h 时已达到了造成危害的程度 ( 过 105cfu / mL) , 一些学者研究表明, 金黄色葡萄球菌在 25℃下 5 h 就可能产生毒素, 因此建议原料奶在 25℃下储存时不要过 4 h。
在 20℃储存 12 h 和 15℃储存 16 h 都达到了造成危害的程度, 因此建议在 20℃储存不要过 8 h,15℃储存应控制在 12 h 以内。在 8℃储存时, 并不是象有些学者说的那样, 金黄色葡萄球菌不生长,而是这种菌对低温环境有一定的适应性, 能缓慢地生长, 但在 24 h 内不会造成任何危害; 在 4℃储存时, 金黄色葡萄球菌的生长基本被抑制, 所以为了提高原料奶的安全性, 储存温度应控制在 8℃以下,能控制在 4℃ ( IDF 认为原料乳在 4.4℃保存时) 左右, 且能在储存 24 h 内加工。
2.3 金黄色葡萄球菌在酸乳制备及冷藏过程中存活的研究
2.3.1 酸乳发酵与冷藏过程中 pH 值与酸度的变化

由于乳酸菌代谢乳糖产生乳酸, 在发酵过程中, pH 值由初的 6.65 降至4.45 ( 到发酵结束时) , 酸度由初的 18.5°T上升到 71.3°T ( 到发酵结束时) 。在冷藏的初 24 h,酸奶继续后熟, 因此 pH 值仍然在不断的下降 (冷藏 24 h 时 pH 值下降到 4.1) , 酸度不断的升高 ( 冷藏 24 h 时酸度升高到 88°T) 。此后 pH 值和酸度变化都不显著。所以酸乳在低温条件下保藏有利于抑制后酸化现象。
2.3.2 金黄色葡萄球菌在酸乳发酵与冷藏过程中菌数的变化
在酸乳发酵结束时, 金黄色葡萄球菌的菌数与初的接种量相比, 只有略微的变化。在冷藏过程中, 菌数减少相对明显。接种量为 15 cfu / mL 的样品在冷藏 24 h 后就检测不到金黄色葡萄球菌了; 接种量为 120 cfu / mL 的样品在冷藏 72 h 后同样检测不到此菌。而在其它三个高接种量的样品中, 随着冷藏时间的延长, 菌数也在不断下降, 到冷藏结束时, 菌数都降低了 1～2 个对数值。造成菌数下降的主要原因是乳酸菌发酵产生乳酸 ( D 型和 L 型) , 导致环境 pH 值下降, 不利于金黄色葡萄球菌生长。
但 Spelhaug 和 Harlander 认为还有一种可能的原因是乳酸菌和金黄色葡萄球菌存在着微生物间的生长竞争作用以及乳酸菌在发酵过程中产生的抗微生物活性物质引起的, 其作用机理还不是清楚, 有待于进一步研究。
接种量为 1.5×105cfu / mL 的样品, 在冷藏过程中, 菌数下降的趋势要比其他样品缓慢的多, 这也说明了金黄色葡萄球菌对酸性环境有一定的适应作用, 并能产生耐酸性。这与 Svanberg 等得出的结论, 他们在研究一种断奶粥的自然乳酸发酵时发现, 即使 pH 下降到 3.8 也不能抑制金黄色葡萄球菌的生长。酸乳发酵与冷藏过程中, 由于乳酸菌的作用, 酸度不断升高, pH 值不断下降。原料乳中金黄色葡萄球菌的初始接种量不同时, 他的存活能力也不同。原料乳中金黄色葡萄球菌数少时, 其存活能力也弱, 当严重时, 酸乳中的低酸环境和他的一些代谢产物不足以抑制金黄色葡萄球菌的生长。所以工厂对原料乳的预杀菌要, 因为预杀菌后的奶一般要在暂存灌中室温储存几小时, 所以预杀菌不, 就会造成这种病原菌的迅速生长, 给产品带来了不安全的因素。

冷热缸

直冷式奶罐

cip清洗系统

真空脱气罐

不锈钢储罐

不锈钢调配罐

乳化罐

不锈钢搅拌罐

过滤设备

蜂蜜浓缩机

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